محاسبات حرارتی استریلیزاسیون کنسروها

از نابود کردن کلیه موجودات زنده موجود در محصول اعم از فرم فعال یا اسپرباکتریها و قارچها و همچنین انگلها و ویروس ها پروتوزواها و غیره به نحوی که در طی نگهداری بعدی نتوانند موجب فساد محصول شوند، اما مقاومت حرارتی میکروارگانیسم و اسپرآنها متفاوت و تابع عوامل مختلفی است و بنابراین در عمل نمی توان از زمان و درجه حرارت معینی برای استریلیزاسیون و محتوی قوطیها کنسرو استفاده نمود. بعلاوه باید در نظر داشت که همیشه نمی توان برای حصول اطمینان از عمل استریلیزاسیون از درجات حرارت بالاتر و زمان طولانی تر از حد لازم استفاده نمود، زیرا هر چند در چنین شرایطی میکروارگانیسم ها نابود می شوند اما تغییراتی نامطلوبی هم در غذا ها ایجاد می شود، از جمله رنگ، طعم، مزه، بافت، ارزش غذایی آنها دچار تغییرات نامطلوب شده و بعلاوه این عمل موجب هدر رفتن مقداری انرژی و وقت می شود.

بنابراین لازم است از حداقل زمان و درجه حرارت برای استریلیزاسیون استفاده شود و همزمان استریلیته محصول تضمین گردد.

از طرفی انجام محاسبات حرارتی برای استریلیزاسیون هر ماده کار مشکلی است و به همین جهت بیشتر متخصصین فن عقیده دارند که می توان یک گونه میکروبی خاص را به عنوان معرف استریلیزاسیون انتخاب نموده و محاسبات لازم را بر اساس مقاومت حرارتی آن انجام داد، برای این منظور معمولاً از باکتری C.Botulinum به عنوان باکتری رفرانس استفاده می شود که علاوه بر بی هوازی بودن و امکان رشد و نمو و تکثیر در قوطیهای کنسرو اسپرساز بوده و در شرایط نامساعد محیط فرم مقاوم یا اسپریاهاگ ایجاد می کند. و ضمناً سم بسیار مهلک و خطرناکی سنتز می نماید که حضور آن در مواد غذایی سلامت مصرف کننده را به طور جدی به خطر می اندازد.

بنابراین زمان و درجه حرارت استریلیزاسیون کنسروها باید طوری انتخاب شود که به طور قطع تمام کلستریدیاها و اسپرآنها از بین بروند و چنانچه پس از استریلیزاسیون و در طی نگهداری در انبارها این باکتری در کنسرو ها دیده شود دال بر عدم کفایت فرآیند حرارتی است.

در مطالعات پژوهشی R & D و… به جای کلستریدیوم بوتولینوم در مطالعات و تحقیقات آزمایشگاهی از C.Sporogens Putrefactive anaerobe PA 3679 وB.Stearothermophilus BS. 1518 نیز استفاده می شود که از کلستریدیوم بوتولینوم مقاوم تر هستند و ضمناً خطرناک نیستند.

مقاومت حرارتی باکتری کلستریدیوم بوتولینوم و خصوصاً اسپر آن مانند هر باکتری دیگری تابع زمان و درجه حرارت PH محیط و نحوه نفوذ حرارت به داخل محصول است هر قدر درجه حرارت بالاتر باشد انهدام میکروب و اسپرهای آن سریع تر است و برعکس در درجات حرارت پایین زمان مقاومت طولانی تر است بدیهی است در این مورد زمان و درجه حرارت هر دو دارای محدوده معینی هستند، و محدوده درجه حرارت مورد استفاده بین حداقل ۸۸ درجه سانتیگراد تا ۱۲۶ درجه سانتیگراد می باشد.

حال اگر تعداد میکروب با اسپرزنده مانده در اثر حرارت معین را در محور Y ها و زمان مجاورت آنها با درجه حرارت مذکور را روی محور X ها منتقل نماییم یک خط راست به دست می آید که به نام منحنی بقاء اسپرها یا Survival Curve نامیده می شود که از روی آن ملاحظه می شود که تعداد اسپرها و سلولهای زنده مانده در اثر حرارت به مرور زمان کم و کم تر شده و به سمت صفر نزدیک می شود، اما با اطمینان کامل نمی توان گفت که در چه زمان و درجه حرارتی در محدوده درجات حرارت و زمانهای متداول در استریلیزاسیون کنسروها تمام اسپرها از بین می روند. محاسبات اولیه مربوط به استریلیزاسیون کنسروها باید روی گونه های شناخته شده اسپر انجام گیرد و اگر این اسپر از کنسروها جدا شده باشد نتایج اطمینان بخش تری به دست می آید.

برای جداسازی و شمارش اسپرها در محاسبات فرآیند حرارتی جهت تعیین D – Value که مبنای محاسبات استریلیزاسیون است، ابتدا باید گونه کلستریدیوم بوتولینوم خالص، جدا شده از کنسرو را روی محیط liver broth یا Differential، Reinforced Clostridial Medium (DRCM) کشت داد، در این محیط گونه های کلستریدیا و سایر بی هوازیها و بی هوازی اختیارها رشد می کنند، اما اگر سولفیت سدیم و سیترات به محیط اضافه شود سولفیت سدیم به وسیله کلستریدیوم احیاء می شود و در اثر تشکیل سولفید محیط سیاه می شود، البته سالمونلا، پروتئوس و اشیریشیاکلی و پاره ای دیگر از میکرو ارگانیسم ها نیز سولفیت را احیاء می کنند، اما اگر قبل از کشت عمل پاستوریزاسیون انجام گیرد میکروارگانیسم های مزاحم از بین می روند.

در عمل مقداری حدود ۱۰ گرم از نمونه مورد آزمایش را در محلول ۱/۰ درصد آب پیتونه تا حد لازم رقیق می کنند و روی محیط کشت می برند و پلیت های کشت شده را در اتو ۳۰ درجه به مدت ۷ روز قرار می دهند، البته ظرف ۴-۳ روز اول کلینها ظاهر می شوند اما محیط سیاه نمی شود مگر پس از حدود ۷ روز که به این وسیله شناسایی اوّلیه انجام می گیرد، پس از این مرحله برای جدا کردن اسپرها از محیط کشت DRCM ابتدا محیط را از روی پنبه مصنوعی یا فیلتر مخصوص عبور می دهند تا سلولها عبور کنند و مواد محیط کشت روی سطح باقی بماند بعد محیط سلولها را مدت ۲۰ تا ۳۰ دقیقه در ۳۵۰۰ دور در دقیقه سانتریفوژ‍ می کنند تا سلولها جدا شوند سپس شمارش سلولها را با روش متداول انجام می گیرد و باید ترتیبی داده شود که طی این عمل یک سوسپانسیون محتوی ۱۰^۱۲ سلول به دست آید، سلول شمارش شده مدت نیم ساعت در معرض دمای ۷۵ درجه سانتی گراد قرار می گیرند تا اسپرولاسیون انجام گیرد، به جای استفاده از حرارت می توان سلولها را مدت یک ساعت در معرض الکل اتیلیک قرار داد برای این منظور سوسپانسیون سلولی جدا شده را با هم حجم آن الکل اتیلیک مخلوط می کنند و یک ساعت به حال خود قرار می دهند.

پس از طی مراحل فوق، سوسپانسیون اسپرهای شمارش شده را به میزان ۷ سانتی متر مکعب در کپسولهای کوچک شیشه ای ریخته، کپسول را به طور کامل بسته و در بن ماری روغن با حرارت مورد نظر قرار می دهند، بلافاصله پس از سپری شدن زمان تماس لازم کپسول را سرد کرده و اسپرهای زنده مانده را در حرارت ۶۵^oC – ۵۵ فعال نمود تا به فرم Vegetaiveتبدیل شود بعد کپسول محتوی اسپرفعال شده را شکسته و محتوی آن را روی محیطDRCM یا Blood agar برده در شرایط بی هوازی قرار می دهند تا سلولهای زنده مانده رشد کنند و شمارش آنها امکان پذیر شود، این کار برای تمام درجات حرارت و زمانهای تماس به همین طریق انجام می گیرد و در صورت عدم کفایت درجات حرارت و زمانهای منتخب می توان ارقام آنها را افزایش داد.

به هر حال تمامی متخصصین ترموباکتریولوژی در این مورد اتفاق نظر دارند که مرگ میکروارگانیسم ها در اثر حرارت بالاتر از ۸۸^oc معادل ۱۹۰^۰F از قوانین لگاریتمی تبعیت می کند. بدین معنی که تعداد اسپرها در درجات حرارت بالاتر از ۱۹۰^۰F به طور لگاریتمی با زمان کم می شود.

 

جدول۱:  درجه حرارت و زمانهای تماس اسپر در معرض آنها برای محاسبه D-Valaue

درجه حرارت ) سانتیگراد( زمانهای تماس در معرض درجه حرارت منتخب ( دقیقه )

 

۱۲۱

۱-۲-۳-۴

 

۱۱۸

۳-۴-۵-۶

 

۱۱۶

۴-۵-۶-۷

 

۱۱۴

۵-۶-۷-۸

 

۱۱۲

۶-۷-۸-۹

 

۱۰۰

۷-۸-۹-۱۰

 

۹۸

۸-۹-۱۰-۱۱

 

۹۶

۹-۱۰-۱۱-۱۲

۹۲

۱۰-۱۱-۱۲-۱۳

 

۹۰    

۱۲-۱۳-۱۴-۱۵

 

۸۸

۱۴-۱۵-۱۶-۱۷

 

 

بنابراین در مدت زمانی از حرات دادن محصول ۹۰% از تعداد اسپرهای اولیه محصول در درجه حرات معین حذف شوند D-Value‌یا Decimal Reduction Time نامیده می شود که می تواند برای درجات حرارت ثابت دیگر نیز محاسبه و بیان شود، درصد تعداد باکتریها که در فواصل زمانی معینی در اثر حرارت نابود می شوند به تعداد سلول اولیه بستگی دارد و اگر در زمان اول ۹۰% از بین بروند و ۱۰% باقی بمانند در زمانهای بعدی به ترتیب تعداد بیشتری از سلولهای باقی مانده از بین خواهند رفت و و تعداد سلولهای باقی مانده به صفر نزدیک می شود اما صفر نمی شود و به عبارت دیگر برای نابودی کامل اسپرها زمان بینهایت لازم است و به همین جهت این عمل استریلیزاسیون تجارتی نامیده می شود، مثلاً اگر تعداد سلول اولیه ۰۰۰,۰۰۰,۱ باشند و محصول ۴D حرارت داده شود هنوز ۱۰۰ سلول زنده باقی مانده و چنانچه ۷D حرارت داده شود هنوز ۱/۰ سلول ممکن است زنده مانده باشد. بدین معنی که از هر ده مورد احتمال آلودگی یک مورد وجود دارد. این امر نشان می دهد که هر چه تعداد سلول یا اسپر بیشتر باشد زمان بیشتری برای از بین بردن آنها لازم است.

 

شکل ۱۳ – نمودار نحوه مرگ و میر اسپرها یا منحنی بقای اسپر( ۵۲)

******************

 

به همین جهت است که برای مدت غذایی حساس در مقابل فساد به وسیله کلستریدیاها یا غذاهایی که دارای PH بالاتر از ۶/۴ هستند، لازم است محصول ۱۲D حرارت داده شود تا احتمال زنده ماندن اسپرها تا حد ممکن پایین بیاید.

اما برای مواد غذایی که محیط مساعدی برای رشد و نمو و تکثیر کلستریدیاها نیستند و PHآنها کمتر از ۶/۴ است. معمولاً ۵D حرارت کافی است و برای غذاهای اسیدی قوی با PH کمتر از ۷/۳ نوعی پاستورایزاسیون برای از بین بردن کپک ها و آنزیم ها کفایت می کند.

 

 

 

 

از لحاظ ریاضی می توان D را از معادله زیر به دست آورد :

 

T = D ( log A – log B )

 

که در آن :

T = زمان حرارت دادن بر حسب دقیقه در حرارت کشنده.

A= تعداد میکروارگانیسم ها در هر گرم محتوی بسته قبل از فرآیند حرارتی.

B = تعداد میکروارگانیسم زنده مانده پس از زمان حرارت دادن t.

بدیهی است هر قدر درجه حرارت بالاتر باشدD ‌ کمتر است و بالعکس.

D = زمان مرگ اعشاری یا DRT در حرارت کشنده.

به تجربه ثابت شده است که هر چه درجه حرارت بالاتر باشد میکروارگانیسم و اسپرهای آنها زودتر از بین می روند و اما باید دانست که منظور اصلی از نابود شدن میکروارگانیسم ها و هاگها چیست، همانطور که قبلاً گفته شد با قبول ارتباط لگاریتمی بین درجه حرارت و زمان و کاهش تعداد سلولها و اینکه در درجات حرارت و زمانهای مورد نظر تعداد اسپرها قاعدتاً به صفر نمی رسد باید دید که در حرات و زمان معین چه تعداد از هاگها از بین رفته یا می روند و در استریلیزاسیون کنسروها معمولاً هدف اصلی کاهش تعداد اولیه اسپرها از ۱۰^۱۲ به ۱۰^o و یا به عبارت دیگر کاهش تعداد اسپرها از تعداد اولیه به  EMBED Equation.3   آن در درجه حرارت معین است برای این منظور باز هم تعداد اسپرو زمان آنها در معرض حرات معین (log D) روی کاغذ لگاریتمی یا نیمه لگاریتمی منتقل می شود و نتیجه آن یک خط مستقیم است به نام منحنی زمان از بین رفتن اسپرها در اثر حرات یا منحنی Thermal Death Timeکه از روی آن می توان به مدت زمان لازم برای از بین بردن اسپرهای مختلف در هر درجه حرارت مشخص پی برد.

 

شکل ۱۴ – نمودار زمان مرگ حراتی اسپرها در درجات مختلف حرات (۵۲)

***************

 

از درجه حرارت حرارت مورد نظر به بالا می رویم تا منحنی قطع شود، از آن نقطه به محورLog D می رویم به این ترتیب زمان به دست می آید، بدیهی است منظور از بین رفتن اسپرها در اینجا کاهش تعداد آنها از ۱۰^۱۲ به ۱۰^o در هر میلی متر است و مثلاً برای از بین رفتن اسپرکلستریدیوم بوتولینوم در درجه حرارت ۲۵۰^oF زمانی حدود ۴/۲ دقیقه کفایت می کند و به این ترتیب برای این اسپر ۰/۲(D) دقیقه است. برای درجات حرارت غیر از ۲۵۰^oFاز رابطه زیر استفاده می شود:

 

 EMBED Equation.3  

 EMBED Equation.3  

که در آنها

T = درجه حرارت انتخاب شده به جای ۲۵۰^oF

^t = زمان لازم در حرارت انتخاب شده.

Z = شیب منحنی TDT بر حسب درجه فارنهایت.

F = زمان بر حسب دقیقه برای از بین بردن میکروارگانیسم ها در ۲۵۰^oF

 

به عنوان مثال اگر بخواهیم از درجه حرات ۲۰۰ فارنهایت به جای ۲۵۰ درجه فارنهایت استفاده کنیم و هدف ما از بین بردن اسپرهای کلستریدیوم بوتولینوم باشد، به راحتی از فرمول بالا استفاده شده و زمان به دست می آید.

در محاسبات حرارتی استریلیزاسیون از واحد دیگری به نام Lethal Value نیز استفاده می شود که از فرمول زیر به دست می آید :

 EMBED Equation.3  

 

که برای هر درجه حرارتی قابل محاسبه می باشد.

 

 بدیهی است درجات حرارت بالاتر و پایین تر از ۲۵۰^oF اثر کشندگی دارند اما باید توجه داشت که به ازای هر ۱۸^oF کاهش درجه حرارت زمان لازم برای به دست آوردن نتیجه مشابه با حرارت ۲۵۰، حدود ۱۰ برابر افزایش می یابد، در فرمولهای فوق Z یا Z-Value عبارت است از تعداد درجات سانتیگراد یا فارنهایت در منحنی TDT که در آن خط مستقیم یا منحنیSurvi val Curue یک سیکل لگاریتمی را طی کند و به عبارت دیگر ده مرتبه پایین بیابد و عبارت است از تغییر در میزان مرگ و میر میکروارگانیسم ها در تغییرات درجات حرارت، هرچه درجه حرارت بالاتر باشد. زمان کوتاه تر و بالعکس. Z در واقع شیب منحنی TDT است و هر چه کمتر باشد شیب منحنی تندتر است و برعکس و F یا F-Value، یا ارزش استریلیزلسیون عبارت است از زمان لازم برای کاهش تعداد معین اسپر با مضرب D در درجه حرارت معین ( معمولاً ۲۵۰ درجه فارنهایت ) در صورتی که Z-Value مساوی ۱۸^oF و اسپر مورد نظر اسپر کلستریدیوم بوتولینوم باشد در این صورت F_۰ خوانده می شوند : F_۰ عبارت است از F.valaue رفرانس برای فرآیندی که در ۱۲۱ درجه سانتیگراد انجام می گیرد. و Zآن ۱۰ درجه سانتیگراد است.

 

 EMBED Equation.3  

 

F۰ برای سبزیها ۶ – ۳ دقیقه، برای کرم سوپ ۵-۴ دقیقه ۵-۴ دقیقه و برای غذاهای دارایPH بالا ۱۲-۱۵ دقیقه است. فرمول فوق ضمناً نشان می دهد که در هر درجه حرارتی مانندT‌مقدار t چقدر باشد تا نتیجه عمل معادل F‌باشد یعنی اگر در ۲۵۰^oF به مدت ۴/۲ تعداد اسپرها تا حد مطلوب کم شود. یا به عبارت دیگر تعداد آنها از ۱۰^۱۲ به ۱۰^oبرسد در حرارت۲۰۰^oF برای بدست آوردن همان اثر کشندگی چقدر لازم است. Z و D خصوصیات مقاومت حرارتی میکروارگانیسم ها را نشان می دهد.

ضمناً چون مقاومت حرارتی اسپرها تابع نوعی محصولی است که در آن قرار دارند لازم است برای موارد مختلف و فرآورده های مختلف از واحد استاندارد کشندگی استفاده شود، این واحد استاندارد را در سیستم متریک F_۰ نامند که بر اساس زمان مرگ اعشاری D-Value یک دقیقه در ۱۲۱^oF و Z-Value ۱۰^oc محاسبه و بیان می شود.

فاکتور Q_۱۰ : در محاسبات حرارتی از فاکتور دیگری به نام Q_۱۰ هم استفاده می شود که ازQuotient گرفته شده و بیانگر این است که مرگ و میر در حرارت T۲ که بالاتر است چقدر سریع است تا در حرارت T۱ و چون برای هر ۱۰^oc بیان می شود Q_۱۰ نامیده می شود و از آن برای مقایسه اثرات افزایش حرارت در فواصل ۱۰^oc بر روی مرگ و میر میکروبها استفاده می شود مثلاً برای مقایسه ۱۲۰^oc و ۱۱۰^oc

 

T۲ – T۱ = ۱۰^oc

 

لازم به تذکر است که در زمان کاهش تعداد اسپرها در حرارت معین از ۱۰^۱۲ به ۱۰^o عملاً تمام اسپرها منهدم می شوند اما احتمال زنده ماندن تعداد بسیار کمی از آنها وجود دارد، در چنین حالتی باز هم امکان فساد و مسمومیت بسیار ضعیف است زیرا برای یک یا تعداد بسیار کم اسپر ایجاد تغییرات لازم در محیط برای رشد و نمو امکان پذیر نیست خصوصاً که اسپر قبلاً در معرض عوامل نامساعد و حرارت بالا قرار داشته و تا حد زیادی تضعیف شده و بنابراین در کنسروسازی حصول استریلیزاسیون مطلق لزومی ندارد و به همین جهت استریلیزاسیون کنسروها که احتمال باقی ماندن تعداد بسیار ناچیزی اسپر در تعداد بسیار ناچیزی از قوطیها وجود دارد را استریلیزاسیون تجارتی نامند.